В настоящее время актуальной задачей в нейробиологии становится визуализация не только морфологии нейронов, но и нейрональной активности in vivo, что достигается с помощью специальных сенсоров, которые флуоресцируют при изменении концентрации различных ионов, например, кальция. Многие современные методы флуоресцентной микроскопии позволяют регистрировать активность нейронов in vivo, однако их применение имеет ряд серьёзных ограничений, а именно: необходимость фиксации экспериментального животного, низкую скорость сканирования, сложность и дороговизну использования. Оригинальным подходом, позволившим решить некоторые из перечисленных проблем, стало использование однофотонных миниатюрных флуоресцентных микроскопов – минископов (Miniscope). Они имеют небольшие размеры при хорошем разрешении, размещаются на голове животного и не мешают его свободному движению, что делает возможным их использование в ходе проведения поведенческих тестов.
Для оценки изменения активности нейронов с помощью Miniscope используются различные индикаторы, например, генетически кодируемый кальциевый индикатор GCamp, сенсоры потенциала на мембране и др., что делает данный метод перспективным в изучении нейрональной активности. Чтобы понять связь между активностью нейронных цепей и поведением, можно использовать оптогенетику и одновременную регистрацию кальциевого сигнала в мозге свободно перемещающихся животных.
В Лаборатории Молекулярной Нейродегенерации (ЛМН) СПбПУ проведены работы по освоению методики имплантации Miniscope для визуализации нейронов гиппокампа in vivo.
В ходе их выполнения были решены следующие задачи:
1) инжектирован вирус (AAV2-GFP) при помощи стереотаксической операции;
2) имплантирована GRIN (градиентной)-линза для фокусировки флуоресценции с поля нейронов;
3) закреплен Miniscope на неподвижное основание.
Был, также, оптимизирован алгоритм проведения стереотаксических операций по введению вируса (AAV2-GFP). Для проверки точности введения вируса в гиппокамп были сделаны снимки на конфокальном микроскопе (Рис.1 A, Б).
Во время стереотаксической операции проводилось удаление слоев мозга до косого хода волокон гиппокампа (Рис.1 В).
После имплантации Miniscope были визуализированы нейроны гиппокампальной области, экспрессирующие GFP (Рис.1 Г).
Таким образом, методика имплантации Miniscope с последующей визуализацией активности нейронов гиппокампа в ЛМН поставлена. В дальнейшем предполагается ее использовать для проведения кальциевого имаджинга in vivo в поведенческих тестах на мышах-моделях нейродегенеративных заболеваний, в том числе, до и после оптогенетической стимуляции клеток астроглии.
Список используемых источников:
1. Ferezou, I. Visualizing the Cortical Representation of Whisker Touch: Voltage-Sensitive Dye Imaging in Freely Moving Mice / I. Ferezou, S. Bolea, C.C.H. Petersen. – 2006. – P. 617–629 – doi: 10.1016/j.neuron.2006.03.043.
2. Ghosh, K.K. Miniaturized integration of a fluorescence microscope / K.K. Ghosh, L.D. Burns, E.D. Cocker, A. Nimmerjahn, Y. Ziv, A. El Gamal, M.J. Schnitzer. – 2011. – Vol. 8 – № 10 – doi:10.1038/nmeth.1694.
Для оплаты (ввода реквизитов Вашей карты) Вы будете перенаправлены на платёжный шлюз